TEMA Nª5 INTRODUCCION A LA INGENIERIA GENETICA

INTRODUCCIÓN A LA INGENIERIA GENETICA

INTRODUCCIÓN

La ingeniería genética es la Tecnología de la manipulación y transferencia de ADN de un organismo a otro.

La ingeniería genética tiene como objetivo:

-Crear nuevas especies.
-Fabricación de compuestos.
-Corrección. De defectos genéticos.
La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre las que destacan:
• La tecnología del ADN recombinante (clonación genética): con la que es posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro.
• La secuenciación del ADN: Técnica que permite saber el orden o secuencia de los nucleótidos que forman parte de un gen.
• La reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue aumentar el número de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una mínima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite para un determinado estudio.
• Las aplicaciones de la ingeniería genética: Son numerosas las aplicaciones prácticas y comerciales de la ingeniería genética.
1.1 ¿QUÉ ES LA CLONACIÓN GENÉTICA?

En términos generales, la clonación pude definirse como la producción de copias idénticas múltiples de un (a) gen, célula, virus u organismos. La clonación genética, suele conocerse también como clonación molecular o tecnológica de DNA recombinante. Existen tres objetivos de la clonación de genes individuales:

1) Contar con muchas copias idénticas de un solo gen (o de un solo numero de genes) hace que el análisis físico del (os) gen (es) sea mucho mas fácil de realizar. Por ejemplo puede determinarse la estructura, es decir la secuencia de nucleótidos, del gen en cuestión.

2) contar con muchas copias de un gen que codifica alguna proteína significa que es posible hacer copias múltiples del producto proteínico de ese gen.


3) Una vez que un gen ha sido clonado, su secuencia de nucleótidos puede alterarse a voluntad ( manipulación genética).

1.2 METODOS DE CLONACION GENETICA

Para clona un gen de interés, es necesario tener la capacidad de hacer cuatro cosas :

1) Contar con métodos de purificación de la material genético( por lo común DNA) que permitan aislarlo de los de mas componentes de la célula.

2) Fragmentar el material genético en piezas mas pequeñas, de modo que el (los) gen (es)de interés pueda (n) aislarse otros genes.

3) Contar con métodos de transferencia del ( los) gen (nes) de interés del tubo de ensayo a una célula viva, donde puedan sintetizarse copias múltiples de ese (sos) gen (nes).

4) Tener la certeza de que una vez que ha sido introducido en la célula, el gen será heredado de una división celular a otra. De esta forma todas las células descendientes contendrán copias del gen de interés.

El organismo de elección para la etapa de propagación es a menudo la bacteria Escherichia coli (E. Coli). Se prefiere este organismo debido a que es fácil de cultivar y está bien caracterizado, tanto genética como bioquímicamente.

Aunque la clonación genética como se ha descrito anteriormente es un sistema totalmente artificial, puede explorarse algunos procesos genéticos naturales bien caracterizados en algunas etapas de dicha técnica para lograr los objetivos planteados.

1.3 PURIFICACION DEL DNA

Hoy en día los métodos que se emplean para purificar el material genético ( ácido nucleico) son fáciles de realizar y confiables. Consisten en el rompimiento suave(lisis) de las células que contienen el gen de interés ( gen blanco o diana) y la posterior separación del DNA de las demás moléculas, como proteínas , polisacáridos (Azucares) y lípidos (grasas) .Esto puede lograrse en parte colocando la mezcla compleja (lisado celular) en un tubo de centrífuga que contenga una solución densa de sal (cloruro de cesio) o azúcar ( sacarosa ). Después de centrifugar a alta velocidad durante varias horas . el ácido nucleico formara una banda especifica en la solución . dependiendo de su densidad .Esto permite separar físicamente al ácido nucleico. La banda se remueve posteriormente del tubo y después de tratarlo con varios compuestos químicos que destruyen cualquier proteína u otras moléculas contaminantes, el ácido nucleico se obtiene en forma pura .

1.4 RUPTURA DEL DNA

Los ácidos nucleicos, en particular el DNA ,son moléculas de gran tamaño .Como tales ,son sensibles a la tensión física y se fragmentan con facilidad. Por lo tanto puede fragmentarse el DNA mediante sonificación (ondas sonoras de alta frecuencia) y otros métodos cortantes .sin embargo, cuando las grandes moléculas de ácido nucleicos se rompen de esta forma, se obtiene fragmentos aleatorios Estos fragmentos carecen de extremos definidos y esto hace que su manipulación subsecuente sea técnicamente mas conveniente sea de técnicamente mas compleja.
Una situación mas conveniente seria aquella en la que el DNA se corte selectivamente en secuencias precisas en forma controlada y repetitiva. Esto se puede lograr mediante el uso de las enzimas conocida como Endonucleasas de restricción. Estas enzimas reconocen secuencias especificas en el DNA de doble banda y catalizan después la ruptura de este en puntos precisos. El resultado neto es la obtención de fragmentos de DNA que poseen extremos definidos. Existen muchas Endonucleasas de restricción. Diferentes enzimas reconocen diferentes secuencias y rompen el DNA en puntos específicos. De esta forma , las endonucleasas de restricción pueden utilizarse para cortar o restringir el DNA blanco en forma controlada.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN.- En 1978 se concedió en premio novel de fisiología y medicina a W.Arber H. Smith y D. Nathans por su trabajo pionero en el estudio de las Endonucleasas de restricción . Se trata de enzimas que las bacterias emplean para destruir el DNA foráneo , generalmente de virus . Estas enzimas reconocen ciertas secuencias de nucleótidos que encuentran en el DNA foráneo ,generalmente de cuatro a diez pares de bases y cortan el DNA en todos los puntos que contienen esta secuencia especifica .(Las Endonucleasas de restricción recibieron este nombre al principio porque “restringian” la infección de fagos entre las cepas de bacterias los fagos que podían sobrevivir en una cepa, y no sobrevivir en otras cepas (con enzimas de restricción diferentes ).

Se conocen tres tipos de Endonucleasas de restricción .Su agrupación se basa en dos tipos de secuencias que reconocen , la naturaleza del corte que hacen en el DNA y la estructura de la enzima . Las Endonucleasas de restricción de los tipos I Y II no son útiles para la clonación de genes porque cortan el DNA por puntos distintos de reconocimiento y por lo tanto dan lugar a patrones en corte aleatorios.

Las Endonucleasas del tipo II sin embargo reconocen puntos específicos y cortan justo por estos puntos. En la tabla siguiente se enumera una selección de enzimas de restricción sus sitios blancos respectivos y los productos finales de la digestión .

TABLA 4.1 _Campo de acción seleccionado de las Endonucleasas de restricción : sus sitios blancos y sus productos de digestión .


Nótese que algunas de esas enzimas cortaran la secuencia del reconocimiento en diferentes puntos de las dos bandas del DNA, es decir, asimétricamente, mientras que otras cortarán la secuencia blanco en la misma posición en ambas bandas .En el primer caso, el producto de ruptura tendrá extremos 5” o 3” salientes con frecuencia conocido como extremos “pegajosos “o “cohesivos”, mientras que en el ultimo caso, se dice que los productos de ruptura poseen extremos “nivelados” o “romos”. La razón de la formación de extremos pegajosos se muestra en las figura sgte.




ADN INICIAL ADN C/ EXTREMOS PEGAJOSOS.

ENZIMA DE RESTRICCIÓN



EXTREMOS PEGAJOSOS

5´----A AGCTT-----3´ 5´----A + AGCTT-----3´
3´----TTCGA A-----5´ 3´----TTCGA + A-----5´


La digestión con la enzima HIND III produce extremos 5” salientes, y una característica clave de este proceso es que cada uno de los extremos libres tiene la capacidad de establecer apareamiento de bases con otro extremo libre producido por la misma enzima. De este modo, las bases de los extremos opuestos del mismo fragmento de DNA pueden aparearse y ,en consecuencias, hacer que se forme un circulo (mediante asociación intramolecular). Aunque es posible que tenga lugar tal apareamiento de bases, cabe decir que trata de una unión no muy no muy estable y que pude romperse con calor. Sin embargo , la unión puede hacerse establecer mediante el uso de otra enzima que finalmente unirá a las moléculas en forma covalente. Esta enzima que se utiliza para unir extremos complementarios ( o extremos romos ). se denomina DNA ligasa .

USOS DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

 Fragmentación de DNA.
 En la clonación de genes .
 Traspaso de información genética.


1.5 PROPAGACIÓN DE GENES

A) VECTORES
El ser capaz de obtener pequeñas piezas o fragmentos del material genético en el tubo de ensayo no es .por si solo, particularmente útil aun cuando se contara con algún método que permitiera transferir este DNA a una célula bacteriana viva, es improbable que esta macromolécula se duplique por si sola fuera de su ambiente normal. De esta forma las células descendientes no poseerán copias del gen extraño.

Existen dos soluciones a este problema : 1) puede hacerse que el DNA extraño se integre al cromosoma ( o genoma ), y 2) el gen extraño puede duplicarse comp. Parte de una pequeña molécula de DNA que se replica en forma autónoma.

Para que cualquier secuencia de DNA pase de una división celular a otra , debe duplicarse de modo que, durante la división celular , una nueva copia del gen o los genes sea transmitida a la célula hija, por tanto, si se desea asegurar la duplicación del gen de interés, debe insertarse en una molécula acarreada de DNA denominada vector. Los vectores tienen la capacidad de auto duplicarse dentro de una célula bacteriana. Por tanto , una molécula de DNA que posee dichas propiedades se denomina duplicón .para los fines de la clonación genética , existen básicamente dos clases de vector, los plásmidos y los bacteriófagos (fagos), que son duplicaciones que existen naturalmente .

PLÁSMIDO.- es una pequeña molécula de DNA circular de doble banda que, en algunos aspectos, es una versión reducida del cromosoma bacteriano. Los plásmidos, poseen a menudo uno o varios genes que confieren resistencia a los antibióticos a las células bacterianas que los contienen .poseen varias secuencias únicas de reconocimiento de Endonucleasas de restricción (sitios de restricción ) para la clonación y en general, son inocuos para la bacteria, hospedante.

LOS FAGOS.- son virus que solo infectan a las bacterias .Inyectan su material genético en la bacteria hospedante, se multiplican (propagan ) y finalmente hacen que la célula hospedante estalle, liberando así hasta varios ciento de nuevos fagos, idénticos que pueden infectar a otra células bacterianas ( figura siguiente ). Los fagos, al igual que la mayoría de los virus, están constituidos por ácido nucleico protegido por una cubierta proteinica protectora. Solo el ácido

PLASMIDO Y GENES DE RESITENCIA.

nucleico del fago se inyectan en la célula bacteriana y ,por si solo proporcionan la información genética que convierte a la célula bacteriana en una “fabrica”, para la síntesis y el ensamblaje de nuevos fagos. Todos los fagos que constituyen la progenie son idénticos y consecuencia, poseen copias idénticas de cualquiera de los genes del fago.

Figura de ciclo de virus

b) Uso de vectores

En principio, si se pudiera insertar un gen blanco de interés ya sea en un vector Plásmido o en un vector fago se podría utilizar cualquiera de estos para insertar el gen blanco en una célula bacteriana, donde duplicaría, si el vector es un Plásmido ,entonces tanto el DNA de este como el gen blanco insertado pueden propagarse por tiempo indefinido en las células bacterianas en proceso de división. Si el vector es un fago, entonces como se duplica en la célula bacteriana hospedante, cualquier fago llevara una copia idéntica del gen blanco. Por supuesto, finalmente esto es letal para la célula bacteriana, pues causa la liberación de muchas copia del fago. Sin embargo, en ciertas circunstancias es posible inactivar la letalidad del virus e insertar

VECTOR

el DNA del fago que contiene al gen blanco en el cromosoma bacteriano, donde se duplicara como si fuere un juego de genes cromosómico normales. En este estado, se programa en forma indefinido sin que cause efecto perjudicial algunos en la célula hospedante.

Los principales bacteriófagos vectores derivan de los fagos o M 13. El bacteriófago es un virus de DNA de doble banda , y es ejemplo del tipo de fago cuyo DNA es capaz de integrarse al cromosoma bacteriano. El fago M13 es mas útil que el fago lambda para ciertas tecnologías. Esto se debe a que el DNA localizado dentro de las proteínas de la capside de las partículas del fago M 13 existe en forma de una sola banda.
Sin embargo, puesto que el fago M 13se duplica dentro de la bacteria hospedarte, existe por u tiempo como DNA de doble banda. De esta forma, se asemeja a un plásmido y se purifica fácilmente mediante las técnicas comunes de aislamiento de DNA de los plásmidos. Cuando existe en forma de DNA de doble banda , el DNA purificado del fago M 13 es susceptible a la actividad de las Endonucleasas de restricción y de la DNA ligasa y de esta forma, pude utilizarse como vehículo de clonación para producir DNA recombinante.

PLASMIDO O FAGOc) Union ( ensamble ) del DNA blanco o diana y el vector

Por ultimo, se requieren métodos que permitan introducir dichos vectores ( con genes blanco ) en una bacteria hospedante.

Sin embargo, se requiere en primer termino unir entre si el DNA diana y el vector .Esto se logra por lo común utilizando la enzima DNA ligasa. Es importante para el ligamiento que el DNA blanco y el DNA vector hayan sido cortados con la misma endonucleasa de restricción. Un mecanismo típico de ligamiento se muestran en la figura. El punto clave de este mecanismo es que la inserción del DNA blanco en el vector ocasiona un gran rompimiento de la integridad de uno de los genes del Plásmido que le confiere resistencia a los antibióticos. Esto hace que se inactive esa función ( inactivación por inserción), de modo que en le Plásmido híbrido o recombinante, uno de los genes de resistencia se habrá perdido, es decir cualquier célula bacteriana que porte este nuevo Plásmido recombinante será sensible a ese antibiótico particular.

DIGESTION CON ENZIMA DE RESTRICCIÓN


GEN EXTRAÑO + DNA LIGASA

NUEVO DNA RECOMBINANTE

1.6 INTRODUCCION DEL DNA RECOMBINANTE EN LA CELULA BACTERIANA

Las moléculas de DNA recombinante de los fagos y los plásmidos tienen un peso molecular muy alto, y como teles no pueden introducirse fácilmente en la célula bacteriana. Sin embargo puede hacerse que las células de E. Coli absorban el DNA a partir de una solución después de someterla a varios “choques” de calor y frió en presencia de calcio. Se dice ahora que las células son competentes. De esta forma las moléculas en solución de DNA recombinante atraviesan la membrana de la célula y alcanzan el citoplasma de la célula bacteriana. Este fenómeno de absorción del DNA por las células bacterianas se denomina transformación en el caso de DNA de los plásmidos y transfección en el caso de DNA del DNA de los fagos. La eficiencia de ambos procesos puede mejorarse utilizando el proceso de electroporación, en el que se aplica una pulsación de lato voltaje a la mezcla de las moléculas de DNA recombinante y células receptoras.

INTRODUCCIÓN DEL ADN RECOMBINANTE EN LA CELULA

Las células se hacen permeables por la pulsación de voltaje, lo que permite que el DNA sea absorbido. Dado que el fago y el Plásmido vectores son duplicaciones, una ves que están dentro de la célula se duplican. Al sembrar las células en placas de agar nutritivo, las células individuales transformadas o transfectadas comienzan a crecer y dividirse como unidades separadas. En cada caso el DNA duplicado es transmitido a las células hijas, dando lugar a clones, cada uno de los cuales deriva de un solo evento de transformación. Todas las células de un clon (consideradas por lo general como una sola colonia bacteriana en una placa de agar) son idénticas con respecto a su contenido de DNA recombinante.